La evolución del gold standar en diagnóstico vírico
¿Sustituirán las técnicas moleculares al cultivo celular o las complementarán?
Conocer cuando una infección es de etiología viral es muy importante porque determina un cambio en la conducta clínica y en el manejo terapéutico del paciente. La detección de virus puede hacerse mediante diversos métodos:
– Cultivo celular
– Detección por anticuerpos
– Detección del material genético vírico
– Observación al microscopio electrónico.
Los métodos modernos de cultivo celular aún se consideran en muchos laboratorios los más precisos y sensibles para el diagnóstico vírico, aunque las técnicas de biología molecular avanzan rápidamente como técnica elegida para la identificación de virus.
El uso de técnicas de cultivo celular para la detección de virus permitió la reducción significativa del uso de animales de laboratorio en este tipo de experimentos. Los cultivos celulares se desarrollan a partir de muestras de tejido que son disgregadas por métodos mecánicos, químicos y enzimáticos para conseguir células apropiadas para el aislamiento de virus.
El método
Para una correcta identificación de virus se prepararan diferentes líneas celulares que son inoculadas con la muestra clínica sospechosa. El éxito del aislamiento del virus depende de la óptima selección, recogida y transporte de la muestra clínica. Una vez en el laboratorio hay que agitar fuertemente la muestra contenida en medio específico y descartar el tejido. Seguidamente se centrifuga el medio líquido de forma que, en pellet que se forme contendrá los hongos, células, bacterias y sangre y será descartado. Mientras que el sobrenadante, conteniendo los virus, será inoculado sobre los diferentes cultivos celulares. Para la inoculación se incuba el cultivo celular con unos 200 microlitros del medio líquido unos 90 min. Posteriormente se retira el medio de inoculación y se añade medio fresco.
Los virus comienzan entonces a crecer. Este proceso puede tardar desde un día a varias semanas en función del tipo de virus. Diariamente se encaminará el cultivo celular inoculado bajo el microscopio y se comparará con un medio sin inocular para detectar las posibles alteraciones del cultivo celular producidas por los virus.
La identificación
Los virus tienen un efecto citopático sobre los cultivos celulares en crecimiento y es fundamental conocer la fisiología, morfología y comportamiento de una línea celular en condiciones normales para detectar los cambios producidos por la inoculación de virus. En cualquier caso, siempre se tendrá como control esa misma línea celular en crecimiento sin inocular.
En función de la línea celular utilizada, el tipo de muestra, el periodo de incubación y el tipo de efecto citopático, el tipo de virus puede suponerse. Aunque, en general, se llevan a cabo test de confirmación como ensayos de inmunofluorescencia basados en la reacción entre el anticuerpo y el antígeno viral para un mejor diagnóstico. También se utilizan anticuerpos monoclonales y, en los últimos años, técnicas de biología molecular tipo PCR para la identificación específica del tipo de virus.
Gracias a los esfuerzos en mejorar el diagnóstico viral se han diseñado nuevas técnicas de cultivo celular que simplifican los métodos, abaratan costes y reducen los tiempos de diagnóstico. Métodos como el cocultivo: la inoculación del virus se lleva a cabo sobre cultivos en monocapa que contienen diferentes tipos celulares, y, que se someten a varios ciclos de detección con diferentes anticuerpos. O métodos como la identificación de virus en líneas transgénicas, esta técnica permite una detección mucho más rápida que los métodos clásicos ya que se utilizan líneas celulares que se han transformado para detectar específicamente un efecto inequívoco del/los virus sospechosos de ser el causante de la infección.