En mi anterior artículo he explicado la importancia de establecer sistemas de control periódico de micoplasma en nuestros cultivos celulares. Para poder elegir nuestro método de preferencia para detectar el micoplasma es muy interesante conocer los que existen, y sus ventajas e inconvenientes.
Una de las fuentes de contaminación más probables es la propia persona que trabaja con el cultivo
Las fuentes más probables de contaminación por micoplasma son los profesionales que manejan los cultivos (Mycoplasma orale), y los medios, sueros y otros reactivos (M. hyorhinis y M. arginini o Acholeplasma laidlawii). Las medidas de prevención recomendables comienzan por adquirir todos los reactivos, especialmente sueros, medios y tripsina, certificados como libres de micoplasma. Además es fundamental conocer y seguir estrictamente las normas de trabajo en condiciones de esterilidad y ofrecer formación específica a las personas que van a trabajar con cultivos celulares. Por último, es conveniente establecer un sistema de revisiones periódicas para eliminar las contaminaciones por micoplasma en fases iniciales y evitar que se propaguen a todos nuestros cultivos, medios y reactivos.
Hay muchas formas de detectar la presencia de micoplasmas en un cultivo, cada una de ellas con sus ventajas y sus inconvenientes
1. Métodos estándar: cultivos específicos. Hay descritos medios de cultivo específicos para micoplasma a pesar de ser microorganismos con condiciones especiales de crecimiento para su visualización. Las colonias de micoplasma crecidas en medios específicos tiene un aspecto característico “de huevo frito” (imagen derecha). Se pueden realizar controles de nuestras células estableciendo cultivos específicos para micoplasmas que requieren entre dos y cuatro para crecer y ser detectables. Uno de los principales inconvenientes de este método de detección es que hay algunas especies no son cultivables lo que impediría la detección de contaminaciones por especies no cultivables.
2. Métodos indirectos: por tinción de ADN y visualización mediante microscopía. Es muy común el uso de colorantes como el Hoechst o el DAPI. Muestras del cultivo de elección son teñidas con colorantes fluorescentes específicos para ADN que se unirán al ADN tanto de las células en cultivo como de los micoplasma si están presentes y que podrán visualizarse con un microscopio de fluorescencia. La presencia de contaminación por micoplasma en el cultivo se visualiza como coloración en las regiones extranucleares y entre las células del cultivo (imagen izquierda). Pero ojo, es una técnica que puede tener falsos positivos por restos celulares u otras sustancias del medio o el colorante que emitan fluorescencia y no sean micoplasmas.
Los principales inconvenientes de algunos de estos métodos son los largos plazos o el riesgo de falsos positivos
3. Técnicas de biología molecular con PCR ó qPCR. Se suelen amplificar regiones de RNA ribosómico (26S ó 16S) compartidas por las especies más comunes de micoplasmas. En un método muy rápido y eficaz para descartar la presencia de micoplasma, sin embargo también se puede obtener falsos positivos por restos de ADN de micoplasma en medios, sueros, etc. que no sean viables, ya que la PCR es una técnica muy sensible que detecta cantidades mínimas de ADN.
4. Métodos bioquímicos por colorimetría. Se comercializan varios ensayos colorimétricos que determinan la presencia de micoplasmas detectando la presencia de determinados antígenos (ELISA) o la activación de receptores de patógenos en líneas celulares. Cada método tiene sus propias ventajas e inconvenientes, por ejemplo, la detección de receptores de patógenos en líneas específicas tiene requerimiento de medios, tiempos de cultivos y compatibilidades; a día de hoy ninguno de ellos se ha propuesto como método generalizado en la detección de contaminaciones.
Existen otros métodos de detección de micoplasmas como la microscopía electrónica, la hibridación de ARN muy poco frecuentes en la rutina de laboratorio de cultivo celular para la detección de contaminaciones por su complejidad o tiempo de procesamiento.
Con este breve acercamiento a los métodos de detección de micoplasma, podemos hacer una primera valoración para elegir cual será el método de preferencia para el sistema de control de contaminación por micoplasma que establezcamos en los cultivos celulares de nuestro laboratorio.