“No es solo saber usar el hardware y el software, sino responsabilizarse de todos los pasos desde que se diseña el experimento hasta que se presentan los resultados”
La citometría de flujo es una técnica compleja que necesita un operador experimentado. No solo esto, necesita quien sepa interpretar y valorar los datos resultantes. Estas necesidades suelen alejar a las personas de esta herramienta de análisis multiparamétrico para el diagnóstico y la investigación realmente eficiente. Desde On Science nos gustaría que se pierda el miedo a la citometría de flujo y, al mismo tiempo, se valore adecuadamente tanto su complejidad como su potencia.
Trabajar con un citómetro de flujo supondrá, no solo saber utilizar el hardware y el software, sino también ser capaces de responsabilizarse de todos los pasos desde el momento que se diseña el experimento hasta el momento en que se presentan los resultados.
La experiencia de On Science en anteriores ediciones de los cursos de Citometría de Flujo nos ha demostrado que el alumno, cuando llega al curso, suele tener muchas dudas acerca del funcionamiento del citómetro, principalmente acerca de la optimización de los ajustes. Muchas veces incluso desazón por haber intentado previamente y con poco éxito utilizar un citómetro. Cuando termina el curso, por supuesto, nadie tiene dudas acerca de los ajustes ni de cualquier otro aspecto sobre el hardware o el software -de hecho, hasta resulta fácil-, sino que además los alumnos son capaces de diseñar, preparar, ajustar, adquirir, interpretar y presentar apropiadamente los resultados de prácticamente cualquier experimento al que tengan que enfrentarse. Desde el primer día y hasta el último realizamos prácticas en los que todos los alumnos, necesariamente, participan de forma activa.
Los cinco procesos
Como ya se ha comentado, saber utilizar un citómetro de flujo consiste, básicamente, en hacer bien cinco cosas: preparar las muestras, optimizar los ajustes del citómetro, adquirir las muestras, interpretar los resultados y presentarlos.
Preparar las muestras: Para conseguir unos resultados claros, con poblaciones bien definidas, es fundamental diseñar correctamente el experimento que vamos a realizar, tratar las muestras apropiadamente y mantenerlas hasta su adquisición. No es solo seguir un protocolo, es ser exquisito en la preparación del mismo. Los mayores problemas pueden venir de no tener en cuenta que las células que estudiamos tienen tendencia a adherirse entre ellas, y dará igual lo bien que hayamos diseñado el experimento, ni lo bien que ajustemos el citómetro, porque nuestros resultados serán poco reproducibles.
Optimizar los ajustes: Consiste en tener preparados los controles necesarios, crear una plantilla apropiada, seguir el diagrama de flujo de la imagen y guardar los cambios. No es difícil si se sabe lo que se está haciendo y para qué. No siempre las poblaciones se van a comportar como en las representaciones de los libros y hay que entender qué se está viendo. Además, es posible que con el despiste se acaben los controles, indispensables tanto para los ajustes, como para la interpretación y presentación de resultados.
Adquirir las muestras: Hay que tener claro el orden en el que las muestras van a ser adquiridas, de nada sirven resultados sin identificar. No se pueden cambiar los ajustes en medio de la adquisición, impide la correcta comparación con los controles y por lo tanto lleva a errores en la interpretación de los resultados.
Desde otro punto de vista, se pueden ahorrar muchos problemas agitando ligeramente las muestras antes de colocarlas en el citómetro; pero es importante ajustar el número de muestras a la experiencia del operador: Hay que trabajar rápido, generalmente en frío y en obscuridad. El tiempo aglutina las células, la temperatura provoca uniones inespecíficas y la luz reduce la emisión de fluorescencia. Es mejor hacer el experimento por tandas que estar más de una hora adquiriendo.
Interpretar los resultados: Si los tres procesos anteriores -preparar, ajustar y adquirir- se han realizado correctamente, interpretar los resultados solo depende del investigador que lo haga y como los relacione, ya que estos son precisos y reproducibles. Con el archivo FCS (Flow Cytometry Standar) generado y mediante cualquier programa apropiado, muchos de ellos gratuitos, se puede trastear con los datos sin miedo en las formas que mejor nos convenga para su análisis. Pero nunca hay que olvidar los controles, los resultados lo son respecto a ellos.
Presentar los resultados: Es obvio que hay que representar los resultados en la forma que mejor se puedan interpretar por el lector. Pero no hay que caer en la tentación de incluir muchas representaciones, hay que presentar justo las necesarias, normalmente el control negativo y el problema: Se presupone que la técnica y los ajustes están bien hechos, no hay que demostrarlo. Solo en el caso de que el ensayo se presente por primera vez, podría ser conveniente incluir los controles positivos para demostrar que la técnica en sí es factible.
Con estos pequeños consejos hemos querido acercar la citometría de flujo al lector, con el objetivo de animar a particulares y empresas a que pierdan el miedo a esta apasionante herramienta y, con la dirección adecuada, aprendan a sacarle el máximo partido.
Alejandro Blázquez Martínez, coordinador del curso de Citometría de Flujo de On Science.